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研域攻略：怎么防止抗體遭受再難？
發(fā)布時間： 2019-08-14 點(diǎn)擊次數(shù)： 1695次抗體問題一向困擾著廣闊科研工作者，抗體市場魚龍混雜，雖然是一個姓名但是每一個對應(yīng)的質(zhì)量都是不同的。小編今日給大家共享一些抗體挑選的經(jīng)歷~
檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供挑選，為縮小抗體的挑選范圍選中適宜的抗體，需求考慮如下幾種因素：
1. 剖析或使用的類型
一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過適用于何種剖析類型，如：能夠使用于 WB IHC ICC ELASA 剖析等，假如抗體說明書沒有提及的使用類型，并不意味著該抗體不適用于此種剖析使用類型，而僅是說明尚未通過此種剖析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，假如抗體不適用某些剖析實(shí)驗(yàn)，則會在抗體說明書上標(biāo)明出來不適于某剖析實(shí)驗(yàn)。
2. 樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)
了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于挑選適宜的抗體，至少兩方面因素需求考慮，待測樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其中的免疫原包含：全長蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體或細(xì)胞，抗體說明書一般都有免疫原的描繪，假如計(jì)劃檢測的是蛋白片斷或一種特別的同型物或蛋白全長的某一區(qū)域，則必須挑選用含此片段域的免疫原制備出的抗體。假如計(jì)劃用 FACS 流式檢測活細(xì)胞的外表蛋白，則需求挑選含該外表蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。
樣本的提取或處理進(jìn)程：某些抗體要求樣本通過某些特別處理，例如：許多抗體只辨認(rèn)復(fù)原和變性的、表位已露出不受二級四級結(jié)構(gòu)阻止的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅辨認(rèn)天然折疊狀況的蛋白。當(dāng)挑選免疫組化的抗體時，應(yīng)注意某些抗體只辨認(rèn)未固定的冷凍的安排，而另一些抗體則適用于無需抗原修正的甲醛固定石蠟包埋的安排，這些都會在抗體說明書上使用部分標(biāo)明出來。
3. 樣本的物種
應(yīng)挑選物種相同或有穿插反響的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有穿插反響，因其氨基酸序列同源性較高，假如樣本的品種未列入抗體說明書上的穿插反響種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測該物種的蛋白，而僅僅表明該物種尚未用此抗體檢測驗(yàn)證過，應(yīng)通過序列比對的方法來猜測穿插反響，可使用 Expasy 和 NCBI BLAST 來進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對。
4. 抗體宿主的品種
一抗的挑選
一般說來，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無偶聯(lián)物的一抗時，一抗宿主動物的物種挑選較為重要，對于免疫組化而言，盡可能挑選與樣本不同種系物種的一抗，從而防止二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生穿插反響，例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)挑選小鼠或大鼠源的一抗，選兔源的一抗，則二抗則可挑選偶聯(lián)了檢測分子的抗兔 IgG。
假如挑選有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對不含 IgG 的細(xì)胞裂解物樣本的 western blotting 檢測，盡管如此，含有血清的安排裂解物和安排培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，復(fù)原變性樣本中含IgG，在western blot 檢測中則結(jié)合呈現(xiàn) IgG 分子50 and 25 kDa 的重鏈和輕鏈條帶。
二抗的挑選
二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來歷，例如：假如你的一抗是小鼠的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗 anti-mouse secondary 。建議查看二抗說明書確保該抗體適用于你的檢測使用， 二抗一般銜接熒光素 FITC 或發(fā)光團(tuán)。
兩層染色抗體的挑選
兩層染色抗體的挑選用未偶聯(lián)一抗進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)物或安排切片的兩層免疫染色要求一抗來歷于不同物種而且二抗別離辨認(rèn)其中之一，二抗說明書應(yīng)描繪其與其它物種來歷的免疫球蛋有否有穿插吸附。